ELISA實(shí)驗(yàn)中稀釋液選擇指南

稀釋液選擇確實(shí)是ELISA實(shí)驗(yàn)的“隱形基石”，選對(duì)了能讓標(biāo)準(zhǔn)曲線更平滑、樣本檢測(cè)更穩(wěn)定。核心原則是匹配樣本基質(zhì)特性+維持抗原抗體活性，既要減少非特異性結(jié)合，又要確保目標(biāo)分子穩(wěn)定。

??? 稀釋液核心成分與功能設(shè)計(jì)

1. 基礎(chǔ)緩沖體系：維持pH與離子強(qiáng)度

Tris-HCl緩沖液（pH 7.4-8.0）

? 優(yōu)勢(shì)：對(duì)酶活性影響小，適用于HRP、ALP標(biāo)記的ELISA

? 配方：50mM Tris + 150mM NaCl，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4

? 禁忌：檢測(cè)酸性敏感抗原（如某些細(xì)胞因子）時(shí)避免使用

PBS緩沖液（pH 7.2-7.4）

? 優(yōu)勢(shì)：生理滲透壓，模擬體內(nèi)環(huán)境，適合抗體、血清樣本

? 配方：137mM NaCl + 2.7mM KCl + 10mM Na?HPO? + 1.8mM KH?PO?

? 變種：含0.05% Tween-20的PBST，增強(qiáng)洗滌效果

?? 樣本類型專屬稀釋液配方

1. 血清/血漿樣本

基礎(chǔ)配方：PBS + 0.5% BSA + 0.05% Tween-20 + 0.01% NaN?（防腐劑）

特殊處理：

溶血樣本：添加1%血紅蛋白吸附劑（如活性炭）

高脂樣本：4℃ 12000rpm離心10分鐘取上清，用含2% PEG 8000的稀釋液

2. 細(xì)胞培養(yǎng)上清/組織勻漿

基礎(chǔ)配方：Tris-HCl（pH 7.5）+ 1% BSA + 0.1% Tween-20 + 5mM EDTA（金屬蛋白酶抑制劑）

優(yōu)化策略：

貼壁細(xì)胞上清：添加0.5% FBS（模擬培養(yǎng)環(huán)境）

腫瘤組織勻漿：含1mM PMSF（蛋白酶抑制劑）+ 10μg/mL aprotinin

3. 小分子物質(zhì)（激素、藥物、毒素）

基礎(chǔ)配方：PBS + 0.1% BSA + 0.1% gelatin + 5% DMSO（助溶脂溶性分子）

?? 常見錯(cuò)誤與避坑指南

1. 稀釋液污染風(fēng)險(xiǎn)

微生物污染：4℃儲(chǔ)存不超過2周，添加0.01% NaN?（終濃度），但HRP標(biāo)記實(shí)驗(yàn)禁用NaN?（抑制酶活性）

交叉污染：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與樣本稀釋液分開配制，使用不同顏色離心管區(qū)分。

通過精準(zhǔn)匹配樣本特性與稀釋液成分，可使ELISA實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）從15%降至8%以下，尤其對(duì)低濃度樣本（如pg級(jí)細(xì)胞因子）的檢測(cè)靈敏度提升2-3倍。記住：沒有“萬能稀釋液”，只有“定制化方案”——根據(jù)抗原性質(zhì)、樣本基質(zhì)和檢測(cè)體系靈活調(diào)整，才能獲得穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)。