ECF Elisa Kit用途：
本試劑盒僅供科研使用，定量檢測細(xì)胞液、體液、組織、血清、血漿等標(biāo)本中ECF的含量。
原理：
采用雙抗體夾心法測定ECF水平。用純化的ECF抗體包被微孔板，制成固相載
體，實驗時依次在微孔板中加入樣本及標(biāo)準(zhǔn)品，并加入 HRP 標(biāo)記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，反復(fù)洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，再用硫酸終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關(guān)。采用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。
ECF Elisa Kit試劑盒組成：
1 | 30 倍濃縮洗滌液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶標(biāo)試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 陽性對照 | 0.5ml×1 瓶 |
3 | 酶標(biāo)包被板 | 12 孔×8 條 | 9 | 陰性對照 | 0.5ml×1 瓶 |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 |
5 | 顯色劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯色劑 B 液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1 個 |
ECF Elisa Kit實驗材料與試劑配制：
1. 儀器與材料：酶標(biāo)儀（使用前預(yù)熱30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水，濾紙。
2. 緩沖液使用：加5ul 的緩沖液于50ul 的樣品中，如果樣品量不夠或者不確定，緩沖液和樣品的混合比例不要小于1:10即可。
混勻，靜置1小時備用（如果標(biāo)本是血清或者血漿，此步驟忽略）。
3. 洗液的配制：按1:100的比例配制洗液備用。
樣品收集、處理及保存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：適用于檢測體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌性成份。用無菌管收集細(xì)胞上清液，以1000×g離心15分鐘，收集上清。
2. 細(xì)胞：用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到104
-106
/ml 左右，通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份，或
者細(xì)胞超聲粉碎，離心取上清液檢測。
3. 血清：在室溫下，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測。
4. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上
清。
5. 體液：包括胸腹水、腦脊液，分泌物等。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘，收集上清。
6. 組織標(biāo)本：切取組織標(biāo)本，稱取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿，以2000-3000
rmp離心20 分鐘，收集上清進(jìn)行檢測。
7. 樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
8. 保存：如果樣品不能立即檢測，應(yīng)將其分裝，-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。血液標(biāo)
本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解
凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
ECF Elisa Kit操作步驟：
1. 取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置 30 分鐘。
2. 分組：取出 96 孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)
品組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。
注：為減少實驗誤差，保證準(zhǔn)確性，建議設(shè)置復(fù)孔。
3. 加樣：依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入 50ul 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入 50ul 的蒸餾水；其余微孔中加入 50ul
的待測樣本。
4. 加酶標(biāo)溶液：標(biāo)準(zhǔn)品組、待測樣本組各孔中加入 100ul 的酶標(biāo)溶液（空白對照孔除外）。
5. 溫育：酶標(biāo)板用封板紙密封后，放入濕盒內(nèi)于 37℃恒溫孵育 1 小時。
6. 洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置 15-30s，充分清洗酶標(biāo)板 5 次，用吸水紙徹底拍干。
7. 顯色：各孔加入顯色劑 A 液 50ul 后，再加入顯色劑 B 液 50ul。
8. 終止：25-37℃下避光反應(yīng) 10-15 分鐘，加入 50ul 終止液。
9. 讀板：在 450nm 波長讀取各孔的 OD 值。
ECF Elisa Kit注意事項：
1. 實驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。
2. 加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免**孔與最后一孔間的時間間隔過大，否則將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時間，從而影響
實驗的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性。
3. 孵育：嚴(yán)格按照說明書上規(guī)定的孵育時間和溫度進(jìn)行。
4. 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如果顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。
5. 建議實驗前預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，計算結(jié)果時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
6. 建議使用本試劑盒時先做預(yù)實驗（即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，試用幾個標(biāo)本），如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經(jīng)銷商聯(lián)系，
如果因運輸過程導(dǎo)致試劑盒失效，可要求調(diào)換，但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失。
ECF Elisa Kit性能
1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
結(jié)果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的待測物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
